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韩伟 熊顺 黄国宁
【关键词】卵母细胞;胚胎体外发育;形态学评分
随着体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术不断进步,卵巢剌激方案和胚胎培养技术的革新已大大提高妊娠率,而伴随的多胎妊娠率也升高。多胎妊娠危及母婴安全,有悖于优生原则。减少移植胚胎数目,推行单胚胎移植是降低多胎出生最有效措施,但困扰胚胎学家的是如何选择最具发育潜能胚胎用于移植。目前,胚胎体外发育潜能的评估方法主要依据胚胎形态学评分,其他选择方法,如对胚胎蛋白组学和代谢组学等方法仍很难被广泛应用,无法代替简便、快捷、又不失效率的形态学评估方法。受配子/胚胎自身因素及体外操作、培养环境的影响,胚胎在体外发育过程中常伴随出现一些形态学上的异常现象,而这些形态学特征往往与其发育潜能相关,但形态学并不能完全准确地反应配子/胚胎的发育潜能,尤其是单一时间点的形态学评分,因此综合考虑配子至胚胎各个阶段的形态学评分将有助于选择较高发育潜能的胚胎用于移植。
一、卵母细胞的评估
1、卵丘-卵母细胞复合体(COCs)形态与卵母细 胞成熟度:颗粒细胞以放射冠状细胞的扩展与受精率、卵裂率和临床妊娠率无关,较密的冠状细胞层与卵母细胞成熟度相关[I]。也有研究认为冠状细胞形态与体外发育潜能、囊胚质量[2]、受精和赶振有关。颗粒细胞粘有血块出现与卵母细胞中心颗粒化有关,对卵母细胞的受精和囊胚形成率有负面影响[I]。依据卵丘-冠状细胞的致密程度可初步评估卵母细胞成熟度,如卵丘,冠状细胞都较致密,可考虑、适宜推迟授精时间。
2、TCSI时MIl卵母细胞评估
( 1 ) *极体(PBl)评估
PBl可用于决定排卵后卵母细胞的年龄,仅从这点看,它可有效预测胚胎发育潜能和种植潜力[3]。有研究表明,与有碎裂PBl的卵母细胞相比,PBl完整 的卵母细胞可获得较高囊胚形成率[4,5]提示这一时期的选择有助于识别囊胚形成和种植潜力的胚胎。这种选择对于不想产生多余胚胎的夫妇或不允许产生多余胚胎的国家具有意义c但更多的研究资料对PBl形态来预测卵母细胞的质量提出了挑战。Ciotti等r6]报道了PEl的形态和受精率、卵裂率、胚胎的质量和任振间没有明显的相关性,而PEl碎片的发生和去卵丘细胞后到ICSI间隔时间有明显的正相关性。PBl的形态因观察的时间而变化,因此认为PBl的形态不能作为一个可靠的指标来判断卵母细胞的质量和发育潜力[7]。
( 2 )MIT卵母细胞异常形态评估
MIl卵母细胞的形态异常,可分为胞质外异常和胞质异常[8]。胞质外异常包括卵母细胞形状异常、透明带异常和卵周间隙异常;胞质异常包括不同类型和不同程度的颗粒化、胞质颜色变化、胞质内出现折射小体、滑面内质网聚集体或胞质出现空泡。
很多研究把胞质外异常和胞质异常结合起来研究,很难了解胞质外异常对胚胎发育和种植潜力的影响,且多种异常形态往往伴随出现,致使对某一异常形态对胚胎发育影响的研究更加困难。早期的研究表明,像卵母细胞透明帝发晴、卵周隙大、卵母细胞形状轻微不规则等胞质外异常与resr后受精率和胚胎质量无关[9]。但透明带的严重异常,如透明带完整性缺失或是透明带质地胶状化,可能影响IVF周期的受精,导致IVF受精失败或异常受精率增加。卵母细胞胞质外异常对reSl结局的影响目前还存争议,可能取决于异常的严重程度以及异常形态的数量。由于胞质外异常和胞质异常往往伴随出现,目前尚无研究证明胞质外异常对胚胎种植力的影响。但作为一个选择标准,它可以用于那些禁止受精后对胚胎做选择的国家。
一般认为严重的胞质异常是卵母细胞发育能力低下的一个反映。诸如胞质发暗、胞质内含有折射体、含黑色物、斑点、一个或多个空泡的胞质异常影响受精以及胚胎的质量[列。Kahraman等研究发现,移植由中央颗粒化卵母细胞获得的胚胎赶振率和种植率降低。卵母细胞出现滑面内质网聚集体影响胚胎质量[10],空泡的出现,尤其空泡>14μm时显著影响受精率 [11] 0 Loutradis等研究胞质异常类型和数量对其发育的 影响,尽管各组的受精率相似,但胚胎质量在卵母细胞出现三个胞质异常形态时会显著地下降。可见胞质异常的严重性和数目对胚胎质量的影响。综上所叙,像细胞器的聚集、中心严重颗粒化、过多/过大的空泡等胞质异常会消弱胚胎发育潜能。但也有存在严重胞质和胞质外异常卵母细胞reSI受精后成功妊娠并分娩的报道[l210所以卵母细胞形态评估可作为参考,但依据卵母细胞的形态决定授精和移植胚胎是不精确的。
二、原核期评估
原核评分是胚胎序列评分和选择的重要组成部分,仅按原核的数目分为正常和异常受精是远远不够的。雌雄原核的排列和核仁的数目、分布与胚胎的发育潜能密切相关。合子发育是一动态过程:原核早期核仁小、多,随机分布在原核内,但随着时间的进行,核仁聚集重排[13];resr原核评分和胚胎质量的相关性要高于IVF胚胎[14],其原因可能是与resr相比,IVF受 精时间不清。现行参照的原核评分(Scott)方法是受 精后16~18h观察原核,而由于操作程序和工作时间的安排,很多实验室原核评分是推后(~20h)的,故此时原核评分对胚胎发育潜能的预测结果可能存在差异。
三、早卵裂期评估
文献报道:较早卵裂的胚胎更倾向于发展为优质胚胎,选择早卵裂胚胎用于移植其妊娠率和植入率更高[15]0 Ciray等[16]提出胚胎卵裂早期的形态对胚胎的发育潜能更具预测价值,较早卵裂且伴较多碎片的胚胎与晚卵裂胚胎的发育潜能最差。不是所有早期卵裂胚胎都具有良好的发育潜能,只有阜期卵裂过程中形成正常单核卵裂球的胚胎更倾向于发育成为优质胚胎,且植入率更高,提示卵裂早期卵裂球分裂的正常启动对胚胎进一步发育具有重要意义。
四、D21D3胚胎评估
卵裂期胚胎的评估主要依据胚胎的发育速度、卵裂球大小均一性、碎片以及多核、空泡等胞质形态进行评分。
l 、发育速度:植入前胚胎的发育有严格时间序列,并随之发生重要事件,胚胎在空间和时间的统一是胚胎正常发育的关键步骤。体外受精使我们可观察胚胎发育过程中各事件发生及其形态学变化,如原核出现在授精后l6~lSh、 *次卵裂发生在受精后20~27h、受精后约44h形成4细胞(4eell )。胚胎的发育速度与其种植力密切相关,研究认为D2移植发育为4e巳11胚胎可以获得较高的妊娠卒,D3移植二",Seell胚胎虹振率显著高于
2、胚胎卵裂球多核:约74%周期、30%胚胎可见多核[2llo多核的产生可能受多种因素影响。体外成熟培养的卵母细胞,在随后的发育过程中,卵裂多核率增加,可能与体外成熟过程中胞质与核的成熟不同步相关;体外培养环境也可能增加卵裂球多核;研究认为Gn时间和量与卵裂球多核相关[21J。有多核卵裂球的胚胎种植潜能降低,染色体异常率高。卵裂球是杏出现多核可能比碎片更能预测胚胎的发育潜能[22J。
3、空泡:胚胎空泡在临床IVF中是一种常见的 现象,可由滑面内质网、高尔基体的囊泡融合形成[36],也可白发出现。研究发现3.9%的卵母细胞在收集时就出现空泡,其中66%有1个空泡,34%有2个或2个 以上空泡,当空泡直径>14μm时受精会受到严重影响;空泡会影响囊胚形成,空泡形成越迟,对囊胚形成的影响越大[IlJ。也有研究认为,由滑面内质网聚集而形成的空泡并不影响妊娠率,而影响流产率和婴儿出生体重。空泡对妊娠结局的影响仍需进一步的研究,如空泡出现的时机以及影响胚胎种植潜力的空泡大小、数量等。
五、囊胚评分
囊胚培养自身就是对胚胎的一种选择。目前被广泛应用的囊胚分级标准为Gardner所提出的评分体系[24],即根据囊胚腔的大小和是否孵化,将囊胚的发育分 1~6期,处于3~6期的囊胚,还需对内细胞团和滋养层 细胞进行评分,依据两种细胞的多少以及排列的紧密程度分别评为A、B、C级。McCormick等[约1利用SNP(单核昔酸多态性)微阵列对m囊胚进行非整倍体检测,结果显示D5发育至4期和5期的囊胚,其非整倍体率显著低于桑草胚期和1~3期的囊胚,囊胚发育越滞后,非整体率越高;滋养外胚层细胞紧密结合的囊胚非整倍体率低于结合松散的囊胚,而内细胞团分级与非整倍体率无关,提示囊胚的发育时期是非常重要的评分指标。Ahlstrom等[26]分析认为滋养外胚层细胞的评级比内细胞团评级更具有预测价值。
由于胚胎发育是一个连续的,不断变化的过程,不可能通过某一时间点的单个参数有效判断胚胎的发育潜能。不同阶段的多重选择相结合才最有可能鉴别具有种植潜能的胚胎。